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激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
发布时间: 2019/06/03 信息来源:新华社区

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用


1激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和发展

科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低,传统的荧光显微镜使用场光源,因标本邻近结构(细胞或亚细胞结构)产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。激光共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT),再经过信号处理,在计算机监视屏上形成图像。由于激光光源的光栅针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔,进行点扫描时,扫描点以外的点不会成像,经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片(Optic section

早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。现在的激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。首先是激光器的快速发展,使得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器,如Ar UV (351,364nm),HeCd(442nm),Ar(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm),Kr(568nm),HeNe(543nm),HeNe(633nm)等。选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。其次是近年来对于激光束分光和荧光采集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采集(见图2),这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长.


2 .共焦显微镜与传统显微镜的区别

1. 抑制图像的模糊。获得清晰的图像




2. 具有更高的轴向分辨率,并可获取连续光学切片。



3. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响。


3 激光扫描共聚焦显微镜的主要生物学应用

3·1 组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测标本制备方法主要有免疫荧光组织和细胞化学法、荧光蛋白标记分子法、荧光细胞染料标记法等。与传统的荧光显微镜相比,除了有较高的分辨率以外,一个主要的不同是激光扫描共聚焦显微镜可以利用激光点扫描成像,形成所谓的“光学切片”,进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像,因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本,特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。

3·2 定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化利用Fluo-3、Fura 2等荧光探针可以测量Ca2+在活细胞内的浓度及变化。一般来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。

3·3 荧光光漂白及恢复技术

利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭,然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式,从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。一般来说,需要用荧光蛋白等标记物标记需要研究的分子,进行细胞转染表达后再做以上的实验。

3·4 长时程观察细胞迁移和生长

目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描,而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高,只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量,从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤,因此,可以用于数小时的长时程定时扫描,记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

3·5 其他的生物学应用

用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验,一般要用紫外激光束进行细胞损毁;细胞间通讯研究;光解笼锁活化技术等。

结语

激光扫描共聚焦显微镜作为一项全新的实验手段和强有力的研究工具,为我们解决一些以往研究工作中不能解决的技术难题创造了条件,因而必将得到更为广泛的应用。随着新软件的不断开发及各个学科 [11-12] 的不断发展和相互渗透,相信它还将会有更广阔的发展前景。










 
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